Проект AP19676357 – Выявление факторов вирулентности изолятов Brucella от домашнего скота в Казахстане методом полногеномного секвенирования

Бруцеллез — самое распространённое, ежегодно регистрируемое, инфекционное зоонозное заболевание сельскохозяйственных животных в Казахстане.

Для выявления больного КРС и МРС будут применяться серологические реакции:  РБП — Роз Бенгал проба и РСК — реакция связывания комплемента (не менее 1000 проб ежегодно). Положительные пробы по результатам серологических тестов будут подтверждены методом ПЦР. Будут выделены и идентифицированы не менее 10 культур в год. Секвенирование полного генома бруцелл будет проведено с использованием технологии Illumina MiSeq.

На основании полученных фундаментальных знаний в будущем, возможно, разработать безопасную вакцину против бруцеллеза животных.

Из 14 регионов Казахстана, в 13 регионах ежегодно регистрируется бруцеллез КРС и МРС. Заражённый скот лечению не подвергается и отправляется на убой, в связи, с чем фермеры терпят большие экономические убытки. От животных заражаются люди, которые длительно и мучительно болеют бруцеллезом, становятся инвалидами и в тяжелых случаях погибают. Таким образом, социальный эффект связан с уменьшением заболеванием людей бруцеллезом, экономический эффект связан с уменьшением экономического ущерба причиняемым данным заболеванием (снижение удоев молока, пожизненное бесплодие, рождение слабого нежизнеспособного молодняка) и будет способствовать международной торговле. Искоренение инфекции позволит предотвратить возможность использования инфекционного агента в качестве биологического оружия против людей и животных.

В течение выполнения проекта будут предоставлены рабочие места для персонала. В результате выполнения проекта сотрудниками будут приобретены новые научные знания и опыт работы в выявлении факторов вирулентности возбудителя бруцеллеза животных и в связи с этим, понимание патогенеза данной инфекции. Результаты будут интересны представителям международного сообщества, осуществляющего исследования в этом направлении.

Наименование темы проекта. ИРН AP19676357 «Выявление факторов вирулентности изолятов Brucella от домашнего скота в Казахстане методом полногеномного секвенирования».  

Цель проекта.

Изучение факторов вирулентности Brucella spp. от сельскохозяйственных животных Казахстана.

Задачи проекта

1) Выявление больных бруцеллёзом животных серологическими тестами.

2) Исследование патматериала сельскохозяйственных животных методом ПЦР.

• Выделение чистой культуры из патматериала больных животных.
• Экстракция  ДНК из культур животных.
• Проведение полногеномного секвенирования Brucella spp.
• Анализ генов вирулентности.
• Анализ изменчивости SNP.

---

Имена и фамилии членов исследовательской группы.

Руководитель проекта. Даугалиева Аида Тлековна    —  кандидат ветеринарных наук, защитила диссертацию по бруцеллёзу, имеет стаж научной работы в ветеринарной сфере — 18 лет, из них в молекулярно-генетических исследованиях -14 лет. Индекс Хирша  (Scopus) =2. Прошла стажировку по освоению молекулярно-генетических методов в следующих исследовательских центрах:  Instituto Zooprofilattico sperimentale, Италия, г.Турин;  Şap Enstitüsü, Турция, г.Анкара; во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Россия, г.Москва, биоинформатическому анализу программного обеспечения BioNumerics в Бельгии. Специалист по  идентификации инфекционных микроорганизмов методами ПЦР, РВ-ПЦР, секвенированию по Сэнгеру, фрагментному анализу, а также 16S метагеномному анализу на секвенаторе Illumina MiSeq, разработке ПЦР тест-систем. Является автором более 100 научных работ. В рамках проекта осуществляет общее руководство проектом, принимает участие в проведение всех работ. (Scopus ID 57201215163, Researcher ID Web of Science O-1991-2017, ORCID ID 0000-0002-7703-7798).

Основные публикации руководителя проекта:

1. Daugaliyeva А., Sultanov А.,  Usserbayev B.,  Baramova Sh., Modesto P.,   Adambayeva A.,  Acutis P.L.,  Peletto S. (2018). Genotyping of Brucella melitensis and Brucella abortus strains in Kazakhstan using MLVA-15. Infection, Genetics and Evolution. 58:135-144. (88%, Q2). DOI: 10.1016/j.meegid.2017.12.022. Citations-14.
2. Aryngaziyev B.,  Beltramo Ch.,  Dondo A.,  Karymsakov T.,  Varello K.,  Goria M.,  Di Blasio A.,  Nodari S.,  Colussi S.,  Modesto P.,  Daugaliyeva A.,  Acutis P.L.,  Daugaliyeva S.*,  Peletto S. (2020). Polymorphisms associated to bovine paratuberculosis:investigation of their role in DNA-protein interactions and transcriptional regulation. Veterinaria Italiana.  56(2):109-114.(65%, Q3). DOI:  10.12834/VetIt.2325.13205.1.
3. Beltramo Ch.,  Karymsakov T.,    Dondo A.,  Aryngaziyev B.,   Daugaliyeva А.,  Varello K.,  Acutis P.L.,  Daugaliyeva S.*,  Peletto S. (2021). Validation of suitable reference genes for quantitative expression analysis by qPCR in bovine terminal ileum and ileocecal valve.  Veterinaria Italiana.  57(3):209-214 (65%, Q3). DOI: 10.12834/Vet. It.2607.16055.1 .Citations-1.
4. Daugaliyeva A., Daugaliyeva S.*,  Ashanin A., Kanatbayev S.,  Beltramo Ch. and  Peletto S. (2022) Study of cattle microbiota in different regions of  Kazakhstan using 16S metabarcoding analysis. Scientific Reports.  12: 16410. Р 1-11. (91%, Q2). Q2. DOI: 10.1038/s41598-022-20732-4.
5. Daugaliyeva A.,  Daugaliyevа S.,* Ashanin A.,  Beltramo Ch.,  Mamyrova L.,  Yessembekova Z.  and  Peletto S. Prokaryotic Diversity of Ruminal Content and Its Relationship with Methane Emissions in Cattle from Kazakhstan. Life-Basel (2022) 12, 1911.  Р 1-13. Q2.  DOI:.org/10.3390/life12111911.

Пелетто Симоне  — доктор ветеринарной медицины DVM, доктор философии PhD, научный сотрудник лаборатории генетики и передовых методов Omics. Работает в Instituto Zooprofilattico Sperimentale Piemonte Liguria and Valle d’Aosta (IZS PLVA) (г.Турин, Италия). Имеет опыт работы в молекулярно-генетических исследованиях -19 лет. Доктор Пелетто занимается изучением генетической резистентности животных к инфекционным заболеваниям, а также молекулярным типированием микроорганизмов, филогенетическими и филогеографическими исследованиями. Доктор Пелетто обладает знаниями в области методов молекулярной биологии и генетики, а также приобрел навыки в технологии секвенирования нового поколения, позволяющей применять геномный подход к исследованиям.  Он является автором и соавтором 94 статей, опубликованных в рецензируемых международных журналах. Индекс Хирша – 28. (Scopus ID 22986339200; ResearcherID Web of Science: K-2005-2016).   В проекте в его обязанности будет входить участие в планировании экспериментов, сборке полных геномов, анализе генов вирулентности, анализе вариаций SNP, помощь в интерпретации результатов. Использование опыта иностранного учёного, должно повысить эффективность и результативность проекта, а также максимизировать шансы на его успешную реализацию.

Абуталип  Аспен Абуталипович, доктор ветеринарных наук, профессор; проводит научные исследования в области ветеринарной микробиологии,иммунологии, эпизоотологии,  инфекционной патологии животных. Исполнитель проектов МСХ РК 2009-2011 г.г.- в «Разработка методов и средств диагностики и профилактики бруцеллеза животных, направленных на  оздоровление  неблагополучных по бруцеллезу  хозяйств»; 2012-2014 г.г.-«Разработка   и   усовершенствование   современных   технологических    приемов    изготовления    высокоэффективных   диагностических    препаратов,   направленных   на   выявление    больных бруцеллезом   животных». Проходил научную стажировку в США (2006), (2007)гг, в КНР (2012) г работал по международному гранту «KZ-2» (2006-2008) гг.

Создал свою научную школу- подготовил 6 кандидатов и 2 докторов наук, 2 докторов PhD, 5 магистрантов.  Стаж  более 40 лет. Всего опубликовал более 230 научных работ, в.т.ч. автор более 35 инновационных патентов РК, 2 Евразийских патентов, 30 рекомендаций и научно-методических работ, 12 НТД на ветеринарные препараты ( вакцины и диагностикумы), 12 монографии, в т.ч. 4 учебника и 3 толковых словарей по ветеринарной медицине. 

Индекс Хирша – 1.  В рамках проекта принимает участие в организации отбора патологического материала от зараженных бруцеллезом животных, проведении эпизоотологических, серологических и бактериологических исследований на бруцеллез. ( ResearcherID:  ORCID 0000-0002-2724-8220 ).

Канатбаев Серик Ганиевич — доктор биологических наук, профессор; специалист по трансплантации эмбрионов КРС мясных пород, по изучению особенностей эпизоотологии бруцеллёза коз и разработки средств диагностики и профилактики этой инфекции. Прошёл обучение в ФГБНУ «Краснодарский научный центр зоотехнии и ветеринарии» по профилактике и диагностике инфекционных болезней животных, Россия. Стаж научной работы -30 лет. Является автором более 200 научных работ, среди которых 7 учебных пособий, 3 монографии, 30 рекомендации, 10 авторских свидетельств и 5 НТД, публикации в базе данных Web of Science и Scopus, ККСОН. Индекс Хирша – 3.  В рамках проекта принимает участие в организации отбора патологического материала от зараженных бруцеллезом животных. (ResearcherID: AFS-7677-2022 ORCID ID0000-0003-0640-4316).

Даугалиева Сауле Тлековна  — кандидат ветеринарных наук; специалист в области молекулярной генетики микроорганизмов. Прошла стажировку по освоению молекулярно-генетических методов в Украинском институте природопользования и биоресурсов, ГНУ «Всероссийский институт мясной промышленности им. В. Горбатого» Россельхозакадемии, ФГУ «Санкт-Петербургский институт управления и пищевых технологий» МСХ РФ. Владеет методами идентификации микроорганизмов: ПЦР, РВ-ПЦР, секвенирования по Сэнгеру, а также 16S метагеномного анализа на секвенаторе Illumina MiSeq. Имеет 24-летний опыт работы в ветеринарной сфере, из них 11 лет в молекулярно-генетических исследованиях. Является автором более 100 научных работ, среди которых Патенты из базы данных Derwent Innovations Index, публикации в базе данных Web of Science и Scopus, ККСОН. Индекс Хирша – 2.  В рамках проекта принимает участие в секвенирование полного генома  Brucella spp ипостановке ПЦР. Секвенирование будет проведено на приборе MiSeq в ТОО «НПЦ Микробиологии и вирусологии». (Scopus Author ID 57211979869  ResearcherID: AAQ-3821-2020 ORCID ID0000-0002-8826-3942).

Адамбаева Акмарал Ауелхановна  — заведующая лабораторией бруцеллёза ТОО «КазНИВИ»; специалист в области  бактериологических исследований при бруцеллёзе животных. Прошла стажировку в Научно-образовательном центре биотехнологии и экологии при ГУ им. акад. И.Г. Петровского г. Брянск, РФ, по освоению метода ПЦР-ПДРФ для генетического анализа КРС по гену Bola DRB3, по работе с возбудителями особо опасных инфекции ІІ-ІV групп патогенности в Национальном научном центре особо опасных инфекции им. М. Айкинбаева,  Казахстан.  Стаж научной работы -19 лет, из них 5 лет в области молекулярной биологии. Является автором более 50 научных работ, среди которых, публикации в базе данных Web of Science и Scopus, ККСОН. Индекс Хирша – 2.  В рамках проекта принимает участие в изоляции и идентификации культур, выделении ДНК. (ORCID: 0000-0002-6093-7853 Scopus Author ID: 57200082345 Web of Science Researcher ID: AGR-1601-2022).

Қыдыр Назерке Серікқызы- магистр  по специальности ветеринарная медицина Казахского Национального аграрного исследовательского университета. В рамках проекта принимает участие в отборе патологического материала от зараженных бруцеллезом животных.

Нұрмолдаев Манат Таңжарықұлы  — бакалавр, по специальности ветеринарная медицина, младший научный сотрудник. В рамках проекта принимает участие в отборе патологического материала от зараженных бруцеллезом животных.

---

Cведения о публикациях основного персонала исследовательской группы по направлению проекта

1) Peletto S., Caruso C., Cerutti F., Modesto P., Biolatti C., Pautasso A., Grattarola C., Giorda F., Mazzariol S., Mignone W., Masoero L., Casalone C., Acutis PL. (2018) Efficient isolation on Vero.DogSLAMtag cells and full genome characterization of Dolphin Morbillivirus (DMV) by next generation sequencing. Sci Rep. 16;8 (1):860 (Scopus 93). DOI: 10.1038/s41598-018-19269-2. Citations-10.

2) Cerutti F., Caruso C., Modesto P., Orusa R., Masoero L., Acutis P.L., Peletto S. (2019). The genome of border disease virus genotype 8 from chamois using next generation sequencing Veterinaria Italiana. 55 (1):103-105 (Scopus 65). DOI:10.12834/VetIt.1768.9338.1. Citations-1.

3) Scarpa F., Sanna D., Azzena I., Cossu P., Mugetti D., Cerutti F., Prearo M., Peletto S., Casu M. (2021). Draft genome sequence of rhodococcus qingshengii strain PN_19, isolated from a moribund individual of pinna nobilis in Sardinia, Italy. Microbiology Resource Announcements. 10(23). DOI:10.1128/MRA.00356-21. Citations-2.

• Yespembetov B.A., Syrym N.S., Zinina N.N., Kanatbaev S.G., Sarmykova M.M., Konbaeva G.M., Basybekov S.Z., Mussayeva A.K., Bazarbaev M.,  Siyabekov S.T. (2019). Phenotypic and genotypic characteristics of Brucella isolates from the Republic of Kazakhstan. Tropical Animal Heals and Production. 51(8):2361-2370. (Q2). DOI: 10.1007/s11250-019-01941-y. Citations-1.
• Yespembetov B.A., Syrym N.S., Syzdykov М., Kuznetsov А., Koshemetov Zh., Mussayeva A.K., Basybekov S., Kanatbaev S.G.,  Mankibaev А.,  Romashev С. (2019). Impact of geographical factors on the speard of animal brucellosis in the Republic of Kazakhstan. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 67 :1-6. (68%). DOI:10.1016/j.cimid.2019.101349. Citations-2.
• Nam I.Ya., Adambayeva A.A., Sultanov A.A., Zayakin V.V. (2021). Genetic polymorphism of Kazakhstan meat breeds of cattle  in relation to resistance to brucellosis. Annals of Romanian Society for Cell Biology. ISSN:1583-6258. 25 (2) : 1781 – 1785.
• Адамбаева А.А., Нам И.Я., Султанов А.А., Заякин В.В., Ахмедов Р.Б. (2019). Генетические особенности больных бруцеллезом коров казахской белоголовой породы. Вестник АПК Ставрополья. ISSN: 2222-9345. 4(36):16-20. DOI: 10.31279/2222-9345-2019-8-36-16-20. Citations-1.
• Даугалиева С.Т., Чужебаева Г.Д., Даугалиева А.Т., Байменов Б.М. (2019). Молекулярно-генетическая характеристика штаммов бактерий. 3i Intellect, idea, innovation – интеллект, идея, инновация. ISSN 2226-6070. 3 :3-9. 
• Даугалиева А.Т., Барамова Ш.А., Усербаев Б.С., Адамбаева А.А., Даугалиева С.Т., Айтлесова Р.Б. (2019). Генетическое разнообразие штаммов Brucella melitensis и Brucella abortus, выделенных от людей и животных различных  областей Казахстана. Микробиология және вирусология. ISSN 2304-585Х. 1(24): 24-31.
• Ә. Әбутәліп, А.Ж. Мырзалиев, О. Түсіпқанұлы, Г. Қыдырова. (2020) Жануарлар бруцеллезін КБР балау тиімділігі. Биоқауіпсіздік жəне биотехнология. ISSN: 2707-7241. 1:11

Результаты 2023 года

1. Выявление больных бруцеллёзом животных серологическими тестами.

В к/х «Актан», Донского с/о,  Хромтауского района и к/х «Мейрбек», Кумсайского с/о, Мугалжарского района, Актюбинской области, было отобрано 300 проб  сыворотки крови от КРС для проведения диагностических исследований на бруцеллез по серологическим реакциям: РБП, РА, РСК, среди которых реагировало положительно по всем 3-м реакциям 9 проб КРС. Взяли патологический материал в убойном пункте СПК «Айбек» от 9 голов скота.

В населенных пунктах «Кулшыкай» и к/х «Байгожа», Каракогинского с/о,  Мендыкаринского района и населенном пункте «Юльев», Сулукольского с/о, Аулиекольского района, Костанайской области, было отобрано 450 проб  сыворотки крови от КРС для проведения диагностических исследований на бруцеллез по серологическим реакциям: РБП, РА, РСК, среди которых реагировало положительно по всем 3-м реакциям 10 проб КРС. Взяли патологический материал в убойном пункте ТОО «Карасу Ет» от 10 голов скота.

В поселке «Чижа», Амангельдинского с/о, Таскалинского района и поселке «Махамбет», Махамбетского с/о, Байтерекского района, Западно-Казахстанской области, было отобрано 200 проб  сыворотки крови от КРС для проведения диагностических исследований на бруцеллез по серологическим реакциям: РБП, РА, РСК, среди которых реагировало положительно по всем 3-м реакциям 5 проб КРС. Взяли патологический материал в убойном пункте ТОО «Салем» от 5 голов скота.

За отчетный период в ТОО «Рауан-Агро», Енбекшиказахского района, Алматинской области, было отобрано   200 проб   крови от КРС и 300 проб от МРС для проведения диагностических исследований на бруцеллез по серологическим реакциям: РБП, РА, РСК, среди которых реагировало положительно по всем 3-м реакциям 8 проб от КРС и 10 проб от МРС. Взяли патологический материал в убойном пункте    «  » от 18 голов скота.

• Исследование патматериала сельскохозяйственных животных методом ПЦР.

 ПЦР были  подвергнуты  пробы цельной крови и паренхиматозные органы от 9 забитых голов КРС в Актюбинской области.  При этом из 4 проб были выявлены положительно реагирующие животные. Данные пробы были направлены для проведение бактериологических реакций.

ПЦР были  подвергнуты  пробы цельной крови и паренхиматозные органы от 10 забитых голов КРС в Костанайской области.  При этом положительно реагирующие животные выявлены не были.

ПЦР были  подвергнуты  пробы цельной крови и паренхиматозные органы от 5 забитых голов КРС в Западно-Казахстанской области. При этом положительно реагирующие животные выявлены не были.

ПЦР были  подвергнуты  пробы цельной крови и паренхиматозные органы от 8 забитых голов КРС и 10 МРС в Алматинской области. При этом из  18 проб было выявлено 8 положительно реагирующих животных.

3) Выделены чистые культуры из патматериала больных животных.

Выделено 12 культур из патматериала больных животных: в Актюбинской области — от 4-х голов КРС. В Алматинской области —  от 3-х голов КРС и 5 голов МРС. Таким образом, результаты ПЦР анализа совпали с результатами бактериологических исследований.

4) Экстрагирована ДНК из культур животных.

Набором GeneJet Genomic DNA Purification  была экстрагирована ДНК из 12 культур животных для дальнейшего проведения полногеномного секвенирования и определена их концентрация флуориметром Qubit® 2.0 и набором к нему QubitTM dsDNA HS Assay.

---

Результаты 2024 года

1. Серологическими тестами было происследовано 1 927 животное (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, верблюды, лошади, собаки). Из них выявили 167 больных бруцеллёзом животных.

2. Исследование патматериала сельскохозяйственных животных методом ПЦР подтвердило 18 больных бруцеллёзом животных.

3. Из патматериала больных животных было выделено 18 чистых культур.

4. Было выделена 18 ДНК из культур животных и 1 культура от человека.

5. Провели полногеномное секвенирование Brucella spp на платформе Illumina MiSeq.

6. Проанализовали гены вирулентности. Гены вирулентности были идентифицированы с помощью базы данных факторов вирулентности (VFDB). Большинство генов попали в группу факторов вирулентности, связанных с опероном LPS (липополисахарид). Другой значительный пул генов факторов вирулентности был представлен генами, кодирующими систему секреции типа IV (virB1-B12). Наконец, два гена (btpA, btpB) кодировали белки, содержащие домен TIR, которые ингибируют созревание дендритных клеток и продукцию провоспалительных цитокинов, увеличивая иммунное уклонение.

7. Проанализовали изменчивость SNP. Обнаружили генетические мутации, в 10 генах факторов вирулентности (VF) (Ure, Omp19, mviN, VceC, prpA, betB, bpe275, bspB, perA, manA) с помощью программного обеспечения BioEdit. Генетические вариации были протестированы на предмет изменения аминокислот в кодирующих последовательностях.

Опубликованные публикации

1. Daugaliyeva A., Daugaliyeva S., Kydyr N, & Peletto S. (2024). Genotyping of the causative agent of brucellosis circulating in the territory of the West Kazakhstan region. Microbiology and virology, 2(45), 145–158. https://doi.org/10.53729/MV-AS.2024.02.09. КОКСНВО.
2. Daugaliyeva A., Daugaliyeva S., Kydyr N, & Peletto S. (2024). «Molecular typing methods to isolate Brucella spp. from Animals: A review». Veterinary world.-V.17.- 1778- 1788. doi: www.doi.org/10.14202/vetworld.2024.1778-1788. Q2. 82%